Испытания в НИИ ВВС прошли не столь гладко, как заводские. Обнаружились сбои в работе 23-мм пушки МП-6, синхронизация пулеметов БС вообще не позволила провести пробные стрельбы в полете из этих пулеметов. Инженером, ведущим испытания в НИИ ВВС, назначили М. И. Таракановского, который участвовал и в заводских испытаниях, а летчиком-испытателем стал П. М. Стефановский. Кроме того, в полетах участвовал С. П. Супрун. Быстро обнаружилось множество проблем. Самолет не мог разогнаться до 585 км/ч. Причиной тому стал слишком маленький размер воздухозаборников. Заводская бригада сумела поставить новые воздухозаборники увеличенного сечения за одну ночь. После этой доработки самолет разогнался до 605 км/ч. Во время испытаний на самолете заменили подтекавший радиатор, перебрали карбюратор, заменили покрышки колес главного шасси. Все эти события никак не отразились на графике полетов. Самолет совершил 42 полета общей продолжительностью 16,5 ч. Это позволило определить основные летные характеристики самолета, но никто не мог предсказать, как самолет поведет себя в глубоком пике, при совершении фигур высшего пилотажа, в штопоре. Пробные стрельбы также не проводились. Государственные испытания заняли шесть суток и закончились 27 июня. Заключение по результатам испытаний гласило:

«1. Предъявленный на госиспытания 1-й экземпляр самолета И-301 с мотором М-105П госиспытания не выдержал из-за непрохождения испытаний на пикирование, штопор, высший пилотаж и отстрел оружия в воздухе.

2. Самолет отвечает заданным летным данным по постановлению КО № 243, за исключением большой посадочной скорости 140 км/ч вместо заданной 110–120 км/ч.

3. Признать, что самолет И-301 представляет несомненный интерес для ВВС как в части своего материала — упрочненная древесина, мощного вооружения, так и в части максимальной скорости — 605 км/ч.

4. Необходимо в кратчайший срок построить второй экземпляр этого самолета, устранить на нем основные дефекты, выявленные при испытаниях первого экземпляра, довести стрелковое вооружение, провести заводские испытания по полной программе и передать его на госиспытания.

5. Признать целесообразным немедленно начать подготовку серийного производства самолета И-301 с М-105П, обеспечив выпуск 25–30 самолетов для прохождения войсковых испытаний в 1940 году. Необходимо просить НКАП особо обратить внимание на этот самолет в части быстроты его доводки и постройки войсковой серии с устранением дефектов…»

В рапорте перечислялись наиболее серьезные из отмеченных недостатков:

— слишком высокая температура в кабине пилота;

— ограниченный обзор из кабины, вызванный низким качеством плексигласа;

— перегрев воды и масла во время набора высоты;

— недостаточная продольная устойчивость;

— слишком высокая нагрузка на шасси при взлете;

— отсутствие посадочного рефлектора;

— отсутствие радиостанции.

Самолет вернули в Химки с целью внести в его конструкцию изменения. После устранения отмеченных недостатков продолжилось дальнейшее совершенствование прототипа. Но в августе 1940 года самолет разбился. К тому времени он совершил 79 полетов общей продолжительностью 32 ч.

11 августа 1940 года самолет удалось подготовить к вылету только к вечеру. Около 19:00 пилот Никашин вырулил на старт.

Полет проходил нормально. Проведя в воздухе полчаса, пилот решил совершить посадку против солнца. Это обстоятельство, а также малые размеры самого аэродрома привели к тому, что посадка оказалась жесткой, и обе стойки главного шасси подломились.

Первый прототип И-301 удалось отремонтировать, при этом в конструкцию планера самолета внесли дополнительные изменения. Кроме того, самолет оборудовали радиополукомпасом. На прототипе провели испытание в пикировании, а также провели пробные стрельбы. Самолет летал до 4 января 1941 года, когда во время полета у самолета не рассыпались подшипники коленвала. Пилотировавший самолет летчик из НИИ ВВС сумел посадить прототип на брюхо, но машина получила столь серьезные повреждения, что ее решили не восстанавливать.

Второй прототип был готов в октябре 1940 года. Минуя этап заводских испытаний, «дублер» сразу направили на государственные испытания. В ноябре на самолете впервые провели испытание бортового вооружения. Следует заметить, что первые испытания пушки ПТБ-23 конструкции Н. Б. Таубина и М. Н. Бабурина, установленной на прототипе Ил-2, показали ее непригодность для использования на штурмовике в связи со слишком сильной отдачей. Доработанный вариант пушки, известный как МП-6, был приспособлен для установки в развал блока цилиндров двигателя М-105П. По результатам испытаний пушки МП-6 на втором прототипе И-301 в октябре 1940 года, появилось решение о начале серийного выпуска пушки на двух заводах (при этом пушка по-прежнему еще не была принята на вооружение). Хотя Таубин и Бабурин стали кавалерами ордена Ленина, пушка МП-6 так никогда и не появилась на серийных истребителях.

Весной 1941 года на подмосковном аэродроме Монино на штурмовиках Ил-2 проводили сравнительные испытания пушек МП-Г и ВЯ-23 (конструкции Волкова и Ярцева). ВЯ-23 показала свое превосходство и была принята на вооружение. Эта неудача ОКБ-16, а также провал создания пулемета АП калибра 12,7-мм привели к аресту Таубина и Бабурина, произошедшему 16 мая 1941 года.